Applicazione di plasma freddo per il trattamento delle cheratiti infettive

The present thesis work describes the development of a "cold" plasma source at atmospheric pressure and the effects of the treatment of biological surfaces by this plasma, with particular interest dedicated to the ocular surface. Low temperature plasma is a partially ionized gas, consisting of molecules, molecular fragments, free radicals with associated emission of UV radiation, having a good antimicrobial effect. From the first studies carried out it seems that this sterilizing effect is mainly due to oxygen free radicals (ROS). The UV radiation emitted by the plasma under examination appears to have a secondary role in the antimicrobial process. In this thesis work, thanks to a collaboration between the Ophthalmology Clinic of the University of Padua and the RFX Consortium of the CNR of Padua, an innovative helium plasma source, called "plasma tube", capable of to sterilize very small surfaces, without damaging or heating them. The aim of the research object of the thesis is to study the potential of the application of cold helium plasma in the biomedical field and, in particular, in ophthalmology, for the treatment of corneal infections that are difficult to treat with conventional therapies. To this end, the effect of cold plasma was analyzed on the basis of a viability study of pathogenic microorganisms, in particular on Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, on Gram-positive Staphylococcus aureus and on Candida albicans and Aspergillus fungi. The influence of the treatment on the viability of human cells was verified with the MTT assay. The presence of ROS in plasma-exposed human cell cultures and any thymine dimers in their DNA were analyzed with specific tests. The evaluation of the effects of plasma on cultured human corneas was performed by histological and ultrastructural analyzes. Among the main results, it was observed that the exposure, of a few minutes, to the plasma of the pathogenic microorganisms significantly reduced both the vitality of the bacterial species analyzed and that of Candida and Aspergillus; the reduction rate is related to the exposure time. The same treatment did not affect the viability of human conjunctiva fibroblasts in culture, nor did it cause damage to their DNA. The amount of ROS in the cultures of the treated cells was high immediately after treatment. However, this amount was reduced by 100% already after 30 minutes. Treatment with plasma of cultured human corneas did not show any significant damage, both from a morphological and ultrastructural point of view. Preliminary tests of treatment of explanted human corneas with induced infection seem to indicate how the plasma produced by the proposed source is able to break down the bacterial load without causing evident damage to the cellular components of the corneas themselves. The cold plasma studied by us, considerably reducing the vitality of pathogenic microorganisms but not that of fibroblasts, can therefore be considered a candidate as a therapeutic agent for the treatment of infectious ocular diseases.

Nel presente lavoro di tesi vengono descritti lo sviluppo di una sorgente di plasma "freddo" a pressione atmosferica e gli effetti del trattamento tramite tale plasma di superfici biologiche, con particolare interesse dedicato alla superficie oculare. Il plasma a bassa temperatura è un gas parzialmente ionizzato, costituito da molecole, frammenti molecolari, radicali liberi con associata emissione di radiazione UV, avente un buon effetto antimicrobico. Dai primi studi effettuati sembra che tale effetto sterilizzante sia dovuto principalmente ai radicali liberi dell'ossigeno (ROS). Le radiazioni UV emesse dal plasma in esame sembrano avere un ruolo secondario nel processo antimicrobico. In questo lavoro di tesi, grazie ad una collaborazione tra la Clinica Oculistica dell'Università di Padova e il Consorzio RFX del CNR di Padova, è stata progettata e realizzata un'innovativa sorgente di plasma di elio, denominata "plasma tube", in grado di sterilizzare superfici molto piccole, senza danneggiarle, né riscaldarle. Scopo della ricerca oggetto della tesi è di studiare le potenzialità dell'applicazione del plasma freddo di elio in campo biomedico e, in particolare, in oftalmologia, per la cura di infezioni corneali difficilmente trattabili con le terapie convenzionali. A tal fine l'effetto del plasma freddo è stato analizzato sulla base di uno studio di vitalità dei microrganismi patogeni, in particolare su batteri Gram-negativi Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, sul Gram-positivo Staphylococcus aureus e sui funghi Candida albicans e Aspergillus. L'influenza del trattamento sulla vitalità delle cellule umane è stata verificata con il test MTT. La presenza di ROS nelle colture di cellule umane esposte al plasma e di eventuali dimeri di timina nel loro DNA sono state analizzate con test specifici. La valutazione degli effetti del plasma su cornee umane in coltura è stata effettuata mediante analisi istologiche ed ultrastrutturali. Tra i risultati principali si è osservato che l'esposizione, di pochi minuti, al plasma dei microrganismi patogeni ha ridotto in modo significativo sia la vitalità delle specie batteriche analizzate che quella della Candida e dell'Aspergillo; il tasso di riduzione è correlato al tempo di esposizione. Lo stesso trattamento non ha influenzato invece né la vitalità di fibroblasti umani di congiuntiva in coltura, né ha provocato danni al loro DNA. La quantità di ROS nelle colture delle cellule trattate è risultata alta subito dopo il trattamento. Tuttavia tale quantità è stata ridotta del 100% già dopo 30 minuti. Il trattamento con il plasma delle cornee umane in coltura non ha evidenziato alcun rilevante danno, sia dal punto di vista morfologico che ultrastrutturale. Test preliminari di trattamento di cornee umane espiantate con infezione indotta sembrano indicare come il plasma prodotto dalla sorgente proposta sia in grado di abbattere la carica batterica senza provocare danni evidenti alle componenti cellulari delle cornee stesse. Il plasma freddo da noi studiato, riducendo notevolmente la vitalità dei microrganismi patogeni ma non quella dei fibroblasti, può essere quindi considerato un candidato come agente terapeutico per il trattamento delle patologie oculari infettive.